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解析韩春雨新版实验方法增加什么内容

2019/08/23 来源:哈尔滨信息港

导读

三个月前,河北科技大学副教授韩春雨在《自然-生物技术》上发表了 NgAgo 酶对哺乳动物进行基因编辑的论文(F. Gao et al. Na

三个月前,河北科技大学副教授韩春雨在《自然-生物技术》上发表了 NgAgo 酶对哺乳动物进行基因编辑的论文(F. Gao et al. Nature Biotechnol. 4, 768 77 ; 2016)。文章介绍了一种新型的基因编辑方法,迅速引起广泛关注。

然而,随着时间推移,研究的可重复性问题为韩春雨团队招致诸多质疑。8月2日,《自然-生物技术》宣布将按照既定流程对研究进行调查。8月8日,韩春雨向质粒共享信息库 Addgene 提交新版的详细实验方法,其中补充了数项应特别注意的问题。

新版实验方法具体分为细胞培养、质粒/gDNA 共转染,以及基因组提取三个部分。对比《自然-生物技术》上 NgAgo 论文 Supplementary Information 中描述的 methods,新实验步骤有几处改变:

1 血清品牌由 Hyclone 变更为 Gibco 。

2 增加了关于 29 T 细胞贴壁不牢,换液时要小心操作 的小提示。

建议在质粒/gDNA共转染的8小时、12小时或24小时后,补转一次 gDNA;旧版方法中只提及了 24小时 。

4 旧版方法中,溶解和稀释质粒及 gDNA 的缓冲液为含有 EDTA 的0.5xTE(5 mM Tris-HCl, 0.5 mM EDTA, pH 8.0),而新方法中则变更为水(pH 8.0)。

一处缓冲液配方的改变尤其引人注意 在韩春雨补充在实验步骤之后的四条注意事项中,EDTA 再次出现:其中一条注意事项专门提到,应该避免向 NgAgo/gDNA 系统中加入EDTA。这四条注意事项分别是:

1 NgAgo/gDNA 系统对细胞中胞内菌和支原体感染敏感,在实验前要仔细确认所使用的细胞株未被污染或污染已被彻底清除。

2 由于 NgAgo/gDNA 系统需要镁离子,在细胞消化和培养过程中要避免使用金属离子螯合剂 EDTA。也可以在培养基中额外加入 5 mM或其他浓度的镁离子。

转染试剂 Lipofectamine 000会阻碍 gDNA 进入细胞,不能用于转染。可以使用转染试剂 Lipofectamine 2000。其他转染试剂是否可用还有待验证。

4 建议使用 T4 PNK (Biolab) 对 gDNA 进行5 端磷酸化处理,处理体系如下:(体系略)处理后的 gDNA 无需再次纯化,直接用水(pH 8.0)稀释至 00 l,终浓度10 nM。

据 Nature 报道,韩春雨近来每天都会收到很多骚扰电话和短信,但他始终坚信自己的研究成果没有问题。Nature 将喜爱茶叶、古琴,并且从未出国的韩春雨称为 隐士 ,而今这位隐士不得不走上风口浪尖,直面质疑。 据新华网消息,河北科技大学将要求韩春雨在一个月内重复实验,并邀第三方证实。

    

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